Prof.Dr. Semih Ötleş

Prof.Dr. Semih Ötleş

Gıda Kimyası

Fenilketonuri hastaları için alternatif bir tedavi: Fenilalanin amonyum liyaz (pal) enzimi kullanımı

Kanda, yüksek miktarda fenilalanin birikmesi sonucunda, zihinsel özür, mikrosefali, spastiklik ve tremor meydana gelebilir. Doğum sonrasında başlamak üzere PKU hastaları yaşamları boyunca düşük fenilalaninli diyetle beslenmek...




Semih ÖTLEŞ, V. Hazal ÖZYURT
Ege Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü


Özet
Yenidoğan metabolizma hastalığı olan fenilketonuri, dopamin, noradrenalin ve aldrenalin nörotransmiterlerin biyosentezini etkileyen tirozine dönüşen zorunlu aminoasit olan fenilalanini metabolize eden fenilalanin hidroksilatlamada kusur veya eksikliğin sonucudur. Kanda,  yüksek miktarda fenilalanin birikmesi sonucunda, zihinsel özür, mikrosefali, spastiklik ve tremor meydana gelebilir. Doğum sonrasında başlamak üzere PKU hastaları yaşamları boyunca düşük fenilalaninli diyetle beslenmek zorundadır. PAL bir memeli enzimi değildir ve geniş sıcaklık aralığında stabildir. PAL, fenilalanini dönüştürmek için kofaktör gerektirmez ve hipurat olarak ürünle beraber salgılanan benzoilaside karaciğerde dönüşen zararsız bir metabolit olan trans sinamik oluşturur. PAL bitkilerde, bazı mantarlarda, mayalarda bulunur ve E.coli’den üretilebilir. Maya hücrelerinde, PAL katabolik bir role sahipken, bitkilerde patojenik durumlar, doku zedelenmeleri, UV radyasyonu ve düşük sıcaklık gibi stres koşullarında biyosentezlenen anahtar bir enzimdir. Kırmızı buğday, beyaz buğday, sonbahar çavdarı, yeşil mercimek, fasulye, soya fasulyesi,  barbunya vb. yüksek PAL aktivitesine sahiptir. PAL’ın optimum pH’sı ince bağırsağın optimum pH’sına yakındır. Ancak bu enzimin aktivitesini bu bölgede gösterebilmesi için korunması gerekmektedir. PAL’ı korumak için PAL yapay hücrelerle immobilize edilebilir, jelatin kapsülleriyle kaplanabilir veya silk fibroin ile tutuklanabilir vb. PAL enziminin üretimi rekombinant teknolojisi ile de oluşturulabilir. 
Anahtar kelimeler: Fenilalanin amonyum liyaz, fenilketonuri, fenilalanin, tirozin
1. GİRİŞ

Fenilalanin amonyum liyaz (PAL), L-fenilalanini transsinamik asit ve amonyağa dönüştüren oksidatif olmayan deaminasyonundan sorumlu olan otokatalitik bir enzimdir (Şekil 1) (Sarkissian ve Gamez, 2005). 



Şekil 1:Fenilalaninin trans sinamik aside dönüşümü (Havir ve Hanson, 1968) 

PAL çeşitli bitkilerde, Streptomyces türlerinde (Kane ve Fiske, 1985), bazı mayalarda (Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula rubra) (Hodgins, 1971; Fritz et al., 1976; Hodgins and C W Abell) ve mantarlarda (Ustilago maydis) (Kim et al., 1996) bulunur. Ayrıca siyanobakterlerden (Anabaena variabilis,  Nostoc punctiforme) (Aydaş et al., 2013) ve E. coli (Kim et al., 2004)’den  sentezlenebilir. 

PAL (EC 4.3.1.5) anahtar bir enzimdir (Whetten ve Sederoff, 1992). PAL enziminin sentezi ve aktivitesinin artışı yaralanmalar, besin eksikliği, etilen uygulaması (Chalutz, 1973), sıcaklık, parazit etkisi, ışık ve mantar enfeksiyonlarınından kaynaklanan stres faktörü ile ilişkilidir (Chmielowska et al., 2008; Hussain et al., 2010; Lopez-Galvez et al., 1996; Pereyra et al., 2005; Heredia ve Cisneros-Zevallos, 2009). PAL, antimikrobiyal bileşen olan fitoaleksinin biyosentezini sağlar. Maya hücrelerinin dokularından elde edilen polisakkaritler bitkisel dokularda daha yüksek PAL aktivitesinin ortaya çıkmasını sağlar (Ronald ve Soderhall, 1985). Ayrıca gama radyasyon uygulamasının PAL aktivitesini artırdığı bilinmektedir (Pereyra et al., 2005).  Yüksek karbondioksit seviyesi ve düşük sıcaklık içeren farklı çevresel şartlar altında depolama ve oda sıcaklığında olgunlaştırma gibi hasat sonrası uygulanan işlemlerde PAL aktivitesini etkilemektedir (Maldonado et al., 2007).

Yüksek bitkilerde flavonoid,  hidroksisinamik asit, kumarinler, stilbenler, lignin ve kondense taninleri içererek bitkisel doğal ürünlerin biyosentezine yol açan fenilpropanoid yol izinin ilk reaksiyonunu oluşturur (Reichert et al., 2009). 

Şekil 2: Fenilpropanoid yol izi

PAL deneysel uygulamalarda ve feniketonuri teşhisinde, endüstriyel uygulamalarda kullanılmak üzere trans-sinamik asitten L-fenilalanin üretiminde endüstriyel kullanımlara sahiptir (Kim et al., 1996).  PAL ayrıca medikal uygulamalara da sahiptir. Bazı fare neoplastik tümörlerinin tedavisi, serum fenilalaninin miktarının belirlenmesi ve düşük fenilalanin diyetlerinin hazırlanması için uygundur (Cunha et al., 1996). 

Fenilketonuri hastalığı (PKU), PAH (fenilalanin hidroksilaz) enziminin eksikliğinin neden olduğu bir yenidoğan metabolizma hastalığıdır. Bu hastalık sonucunda fenilalanin tirozine dönüşemez ve kanda fenilalanin miktarında artış gözlenir.  Düşük fenilalaninli diyet uygulanarak yüksek fenilalanin seviyesi azaltılabilir. Ancak bu diyetin takip edilmesi zordur, ateş ve enfeksiyon sırasında kandaki fenilalanin seviyesinin yükselmesi önlenemez. Bu diyet için mümkün olan alternatif enzim tedavisinin kullanımıdır. Memeli dokularından PAH enziminin izolasyonu ve saflaştırılması bir problem oluşturmaktadır. Ayrıca, bu enzimin çalışması için kofaktöre gereksinim duyulmaktadır.  PAL, PAH proteinin yerine geçebilen bir enzimdir.  Bu enzim kofaktör gerektirmez ve bitkisel ve mikrobiyal kaynaklardan elde edilebilir (Bourget ve Chang, 1985) (Şekil 3). 


Şekil 3: (A) PAH enziminin reaksiyon şeması, (b) PAL enziminin reaksiyon şeması (Kim et al., 2004)

Diyete PAL eklemek alternatif bir tedavi yöntemidir. Fenilalaninin dönüşümü sonucu oluşan transsinamik asit zararsızdır (Levy, 1999) ve daha sonra hippürik aside dönüşecek olan benzoik aside dönüşür. Transsinamik asidin laboratuvar hayvanları denemelerinde hiçbir embriyotoksik etkisine rastlanmamıştır. Günlük olarak PAL tarafından oluşturulan yaklaşık 3 g transsinamik asit miktarı hem PKU’lar için hem de normal bireyler için zararsızdır. Oluşan amonyak ise metabolik olarak önemsizdir (Sarkissian ve Gamez, 2005). Amonyak ve hiperammonemia tehditi oluşturacak şekilde vücutta birikmez. PKU’ nun tedavisi için kandaki feninalanin konsantrasyonunun yüzde 70-80 azalması gerekmektedir. PAL tirozin üretimine neden olmaz. Eğer PKU’nun beyin etkisinde tirozin bir faktörse, bu duruma dikkat edilmesi gerekmektedir (Levy, 1999).

PAL aktivitesi için gerekli olan sıcaklık 30 ºC ve pH 8.5’dır (Sarkissian ve Gamez, 2005).  Geniş sıcaklık aralığında stabildir.  Rhodotorula glutinis’ten elde edlen PAL aktivitesini kaybetmeden 6 ay boyunca -60 C’de depolanabilir (Kim et al., 2004). Bu özellikler gastrointestinal sistemle uyumludur ancak, eğer bu enzim korunmazsa, enzimin intestinal lümende proteolitik degredasyonu normal olarak gerçekleşecektir. Bir başka seçenek olarak, protein onun bağışıklığını bastırmak için modifiye edilmeden enjekte edilirse, bağışıklık sağlanacaktır (Sarkissian ve Gamez, 2005). Bu nedenle bu enzimin korunması için alternatif yolların geliştirilmesine ihtiyaç vardır. 

2. BİTKİLERDE PAL ENZİMİ

Bitki hücrelerinde doğal olarak enkapsüle halde bulunan PAL’ın ağızdan tedavisi fenilketonuriden kaynaklanan hiperfenilalaninemik hastaları için alternatif bir tedavi sağlayabilir. Goldson et al. (2008) çalışmalarında PAL aktivitesi yüksek olan bitkileri tespit etmişlerdir. Bitki hücrelerinde doğal enkapsüle haldeki bulunan PAL’ın, PKU hastalarında fenilalanin toleransını artırmak için diyet desteği olarak kullanılabilirliğini araştırmışlardır.  Bu çalışmada PAL enziminin aktivitesine bakılarak en iyi kaynağı tespit edilmiştir. Enzimin konsantresi ve stabilitesi için optimum şartların tanımlanması için farklı dehidrasyon metotları geliştirilmiştir (Şekil 3).

Şekil 3: Çeşitli meyveler, tahıllar ve tanelerin PAL aktivitesi için tanımlanması 
Yapılan çalışma sonucunda, enzim aktivitesinin tahıl fide örneklerinde en yüksek olduğu bulunmuştur. En yüksek enzim aktivitesi 7 günlük kırmızı buğdayda (Triticum aestivum L.) bulunmuştur. Buğday fidelerinin yaprak ve kök/endospermlerinin PAL aktivitesi sırasıyla 11.90 ± 2.64 ve 6.48 ± 1.59 µmol h-1 g-1 kuru ağırlıktır Goldson et al. (2008). 
Lam et al. (2008) fenilketonuri hastaları için diyet desteği olarak kırmızı buğday fidelerinin kullanılabimesi amacıyla PAL aktivitesinin depolama boyunca değişimin ve in vitro protein sindirimi sonucu değişimini değerlendirmişlerdir. -20 ºC’de 3 ay depolanan dondurularak kurutulmuş kırmızı buğday fide dokularındaki PAL aktivitesinin alıkonması yapraklarda yüzde 62 iken kök ve tohumlarda yüzde 89’ dur. 3 saat sonra in vitro sindirimde mide ve bağırsak bölgelerinde doğranmış taze yapraklarda ve köklerde PAL aktivitesinin geri kazanımı sırasıyla yüzde 36 ve 42’dır, ancak dondurulmuş dokularda in vitro sindirimde hiçbir aktivite gözlenmemiştir. In vitro sindirim sonrası kalıntı fenilalaninin HPLC analizi taze dokularda dönüşümün dondurulmuş dokulara göre daha yüksek olduğu yönündedir. Bu sonuçlara göre in vitro sindirim boyunca PAL’ın korunmasının bitki hücre duvarları aracılığıyla sağlandığı dondurulma boyunca bu hücre duvarının zarar gördüğü ve sindirim sırasında etkisinin azaldığı kanıtlanmıştır (Lam et al., 2008). 

3. İMMOBİLİZE PAL ENZİMİ

PAL çözülebilir bir enzimdir (Martinez-Tellez ve Lafuente, 1997).  PAL’ın PKU tedavisi için immobilize olarak kullanımı ilk olarak 1980’lerde ortaya çıkmıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalar genellikle mayalar tarafından üretilen PAL enziminin tutuklanması yönündedir.

Rhodosporidium toruloides’den elde edilen PAL’ın pH 2.2’de hiçbir aktiviteye sahip olmadığı ve duodenal sıvıda yarılanma ömrünün 3.5 dakika olduğu tespit edilmiştir.  Duodenal sıvıdaki PAL’ın inaktivasyonu bu bölgedeki enzimlerden kaynaklanmaktadır ve PAL kimotripsine karşı tripsine göre daha hassastır. Yapılan bu çalışma sonucunda, intestinal sıvılardaki PAL’ ın aktivitesini korumak için öncelikle PAL’ın intestinal proteolisisten korunması gerektiği anlaşılmaktadır ve PAL’ın üst gastrointestinal bölgede bulunan pH seviyesinden de korunması gerektiği tespit edilmiştir (Gilbert ve Tully, 1985). Böyle immobilizasyon yöntemleri uygulanmaya başlamıştır. Ancak, bu çalışmalar PAL’ın izolasyonunun maliyetinin yüksek olması dolayısıyla bu çalışmalar çok sınırlı kalmıştır.  Doğal kaynaklardan saflaştırılan PAL ile tedavinin her hasta için günlük fiyatı, fenilalaninsiz diyetle tedavinin yıllık miktarına yakın olduğu hesaplanmıştır (Sarkissian, ve  Gámez, 2005).
Rhodotorula glutinis ve Rhodotorula rubra’dan saflaştırılan PAL sert jelatin ve enterik-kaplı kapsüller (50 U each, SA 1.2 U/mg) içinde paketlenmiştir. Enterik-kaplı kapsüller kandaki fenilalanin seviyesini başlangıcına göre yüzde 22 azaltmıştır. R. glutinis ve R. rubra’ dan elde edilen PAL’ın optimum pH’sı sırasıyla 8.75 ve 8.0’ dır (Abell ve Shen, 1987; Gilbert ve Tully, 1985). İnce bağırsağın ortalama pH sına yakın olan bu pH’lar PKU’nun ağızdan alınan enzim tedavisinde birçok avantaja sahiptir (Gilbert ve Tully, 1985).
Bourget ve Chang (1984) yapay hücrelerde PAL (R. glutinis)’ı immobilize etmişlerdir. Yapay hücrelerle immobilize edilen PAL’ın PKU’ lu ratlarda fenilalaninsiz diyete göre daha etkili sonuçlar gösterdiği tespit edilmiştir.  Kan plazmasında, bağırsaklarda ve beyin-omurilik sıvısındaki fenilalanin düşük fenilalaninli diyet sonucu bu bölgelerdeki fenilalanine göre çok daha düşük olduğu tespit edilmiştir (Bourget ve Chang, 1986; 1989). 

Bourget ve Chang (1989) fenilketonurik farelerde fenilalaninin azaltılması için immobilize PAL enzimi geliştirilmişlerdir. Normal farelerle karşılaştırıldığında fenilketonurik farelerdeki kandaki fenilalanin seviyesi 15-20 kat daha yüksektir. Yapay hücrelerle kaplı PAL’ın 1 biriminin ağızdan alımı sonucunda fenilalanin seviyesi yüzde 58±18’e 7 günde düşmüşken, 5 birim alınması sonucunda fenilalanin seviyesi yüzde 25±8’ e düşmüştür. 5 birim immobilize enzim 6 günde fenilalanin seviyesini normal seviyelere düşürmüştür. Fenilketonurik farelerin normal davranışlar sergiledikleri ve kilo kayıplarının olmadığı gözlenmiştir. Yapay hücreler içindeki immobilize olan enzim düşük gastrointestinal pH’ya ve proteolitik enzimlere karşı korunmaktadır. 
Chang et al. (1995) PKU’lu modellerde yapay hücrelerle mikroenkapsüle PAL ağızdan alınmasının fenilalaninli diyete göre daha etkili olduğunu tespit etmişilerdir. Yapay hücrelerdeki bu enzimin bağırsak, kan plazması ve beyin-omirilik sıvıdaki fenilalanini düşürmede daha etkili olduğu tespit edilmiştir. Fenilalaninsiz diyetle karşılaştırıldığında hastalarda kilo artışı ve genel fiziksel şartların daha iyi olduğu belirlenmiştir. Asparajin, glutaminaz ve tirozinaz ile mikroenkapsüle edilen yapay hücrelerin bağırsaktaki aminoasitleri azalttığı gözlenmiştir. Ancak mikroenkapsüle PAL’ın ağızdan alımının ılımlı PKU hastalarında daha iyi sonuçlar verdiğini tespit etmişlerdir (Bourget ve Chang,1989; Chang et al., 1995). 

Mikroenkapsüle PAL’ın bir dezavantajı doğal enzimin aktivitesinin yüzde 20’sine sahip olmasıdır.  Mikroenkapsülasyonla enzim aktivitesinin azalmasının üstesinden gelebilmek için alternatif yaklaşımlar araştırılmaktadır. Bağırsak sıvısındaki PAL’ın aktivitesini artırmak için PAL silk fibroin (ipek teli) ile tutuklanmıştır. Tutuklanan enzim serbest enzimle birlikte fenilalanin için benzer Km ve optimum pH değerlerine sahiptir.  Tutuklanan PAL direkt olarak fare oniki parmak bağırsağına enjekte edilmiştir ve plazmadaki sinamat (ürün) enzim aktivitesinin kanıtı olarak tanımlanmıştır. Tutuklanan enzimlerde plazmada sinamat (ürün) artışı gözlenirken, serbest olanlarda gözlenmez. Bu sonuçlara göre tutuklanmış enzimin bağırsak bölgelerinde fenilalanini yıkıma uğrattığı gözlenmektedir. Fibroinde tutuklanan fenilalanin amonyum liyaz fenilketonurinin ağızla enzim tedavisine yeni bir bakış açısı katmaktadır (Inoue et al., 1986).

PAL’ın ağızdan alımı hastalar için çok büyük rahatlık olmasına rağmen, PAL tedavisinde ebeveynlere ihtiyaç duyulmaktadır. Kandaki ve istenmeyen immünolojik yanıtlardaki enzimlerin kısa yarılanma süresine yol açtığından PAL’ın yüksek immunojenik özellikleri ebeveyn destekli PAL tedavisi için ciddi bir problem oluşturmaktadır. Bu problemlerin üstesinden gelebilmek için, immobilize PAL (R. glutinis) içeren çoklu enzim-reaktörleri geliştirilmiş ve hızlı sonuçlar elde edilmiştir. PKU hastalarının kan örneklerinde fenilalanin içeriği yüzde 77 azalmıştır  (Kalghatgi et al., 1980; Ambrus, 1982).  

Larue et al. (1986) kandaki fenilalaninin azalması için in vitro içi boş lifli kan süzdürücü (hollow-fiber hemodialyzer) ile immobilize edilen PAL enzimi kullanmışlardır. Fenilalaninin sürekli azalması 1 saat içinde gerçekleşmiştir. Bu reaktörle hiperfenilalaninemia(hamile kadınlarda PKU)’nın kısa süreli tedavisi sağlanır (Kim et al., 2004).

Rhodotorula rubra (IFO 1101)’dan ekstrakte edilen fenilalanin amonyum liyaz yassı tanecik kan sulandırıcı ajan (platelet antiaggregating agent) ile fiziksel karıştırma uygulanarak kan ile uyumlu selüloz triasetat liflerde immobilize edilmiştir. Tutuklanan enzimlerin fenilalanin ve tirozin üzerinde etkili olduğu tespit edilmiştir. Tutuklanan enzim 50 günden fazla orijinal aktivitesini koruyarak kanda muhafaza edilebilmektedir (Marconi et al., 1980). 
PAL yarı geçirgen mikrokapsüllerde standart metotlarla immobilize edilmiştir. Yarı geçirgen mikrokapsülleri sağlamak için yapay hücreler olarak da adlandırılan ultra ince selüloz nitrat membran kullanılmıştır. PAL hemoglobin çözeltisinde çözüldükten sonra çok ince selüloz nitrat membran oluşturularak mikrodamlacıklar (150µm) oluşturulmuştur.  Ayrıca, ağızdan alımın etkinliğini test etmek için in vitro çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Gastrointestinal bölge boyunca gerekli pH değerinde immobilize enzimin optimum pHsı test edilmiştir. Hem serbest enzim için hem de immobilize enzim için optimum pH 8.5± 1.0 olarak saptanmıştır. Bu değer ince bağırsağın optimum pH’sı ile benzerdir.  Yapay hücrelerde in vivo olarak farelerde test edilmiştir. Fenilketonurik farelerde kan fenilalanin seviyesi yapay hücrelerle immobilize edilmiş PAL’ın ağızdan verilmesiyle azalmıştır. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında fenilalanin kan seviyesi 2 günde yüzde 65±8’e 7 günde yüzde 25’e azalmıştır (Bourget ve Chang, 1985).

Mikrokapsül membranı olarak selüloz nitrat kullanarak arayüzey koaservasyon tarafından PAL’ı mikroenkapsüle edilmiştir. Mikrokapsüller karıştırma yardımıyla doygun eterli sulu yüzde 10’luk hemoglobin çözeltisinde PAL’ın dağılmasıyla elde edilmiştir. Sonra eter:etanol (82.5:17.5,v/v) karışımındaki selüloz nitrat dispersiyona eklenmiştir. Selüloz nitrat çok hidroskopik olduğundan mikrokapsüllerden oluşan sulu faz tanecikleri çökerler. Mikrokapsüller Tween 20 ile yıkanarak n-bütil benzoat tarafından sertleştirilmiş ve sonuç olarak Tris tamponu içinde dağılmıştır (Habibi-Moini ve D’mello, 2001). 

Shah ve D’mello (2008) da mikrokapsülleri selüloz nitrat kullanarak (Habibi-Moini &D’mello, 2001) oluşturmuşlardır.  Mikroenkapsüle edilen PAL enziminin aktivitesi Tris tamponundaki PAL’ın aktivitesinin  yüzde 23’ü kadardır.  Bu daha düşük aktivitenin enzimin tamamen enkapsüle edilememesinden ve mikrokapsül üretimi sırasındaki kayıplardan kaynaklandığı düşünülmektedir. Bu çalışmada çözeltideki polimer konsantrasyonu, karıştırma hızı ve sulu faz hacminin organik faz hacmine oranını içeren oluşum parametreleri PAL’ın enzim aktivitesini artırmak için optimize edilmiştir. Optimum koşullarda oluşturulan mikrokapsüllerdeki PAL aktivitesi yüzde 80’dir. Enzim aktivitesindeki artış orijinal mikrokapsüllerdeki aktivite ile karşılaştırıldığında enkapsüle PAL’ın aktivitesindeki artış yüzde 119’dur. 
Zhang et al. (2011) PKU tedavisi için Lactococcus lactis’den üretilen PAL (LLEP)’ı kullanmışlardır. pH’ya hassas Ca-alginat mikropartikülleri PAL enzimini spreyle katılaştırma uygulanarak hazırlamışlardır. Sprey şartları Ca-aljinat partiküllerinin büyüklüğünü etkiler, böylece ağızdan alıma uygun partikül büyüklükleri elde edilmiş olur. Çalışma sonucuna göre, LLEP gastrik sıvıda korunabildiği ve son durumdaki enzim aktivitesinin yüzde 92.9 olduğu tespit edilmiştir. Aljinat konsantrasyonunun enkapsülasyon etkinliğine etkisi üzerine çalışılmıştır. Alginat konsantrasyonu yüzde 1 olduğunda en yüksek enkapsülasyon etkinliğine sahip olduğu gözlenmiştir. Optimum sprey şartları ile birlikte aljinat konsantrasyonu LLEP enkapsüle mikropartikülleri hazırlamak için kullanılmıştır ve bu mikropartiküller PKU’lu farelere uygulanmıştır. LLEP mikropartikülleri ile beslenen farelerin kan fenilalanin seviyelerinin 7 gün içinde düştüğü gözlenmiştir. 
İmmobilize PAL fenilketonuri hastalığınn tedavisi için kullanımının yanı sıra idrarda fenilalaninin teşhisi içinde kullanılmaktadır. Bu amaçla kullanılan PAL, destek materyal olarak kullanılan poliester film (asetat) üzerine, jelatine immobilize edilmiştir. Bu immobilize enzim idrarda fenilalanin analizi için kullanılmıştır. Ayrıca immobilize fenilalanin amonyum liyaz enzimi içeren poliester stripler, 4oC’da borat tamponunda (pH 8,7) 90 gün boyunca depolanmışlardır. İmmobilize enzim depolama boyunca görünür aktivitesini büyük ölçüde koruduğu tespit edilmiştir (Ateş ve Doğan, 2010). 

REKOMBİNANT PAL ENZİMİ

Sarkissian et al. (1999) Çalışmalarında yüksek miktarda rekombinat PAL üretmişlerdir. Rekombinat PAL’ın etkinliğini test etmek için E.coli’den salgılanan hücre ile PAL kaplanmıştır. PKU’lu farelerle yapılan denemelerde bu formülasyonun kan plazmasındaki fenilalanini düşürdüğü gözlenmiştir. Bu tedavi olumlu etkilerine rağmen, düşük enzim aktivitesine sahipolduğu ve pH 7.0 de etkisiz olduğu için tercih edilmemektedir (Kim et al., 2004).  

PEGlasyonla PAL ENZİMİ

R.glutinis’ten elde edilen PAL’a immunoreaksiyonlar derecesini azaltmak için PEGlasyon metodları uygulanmaktadır. Doğal PAL’ın yarılanma ömrü enjeksiyon sonrası 6 saat iken, PEG-PAL için 20 saattir. PEG-PAL ağızdan alım öncesinde ek uygulamalar gerektirebilmektedir (Gamez et al., 2005). 

SONUÇ

PKU’yu tedavi etmek için klasik diyet desteklerine alternatif veya ek olarak yeni yöntemler geliştirilmektedir. Bu araştırma mide ve bağırsaklarda PAL enzimini inaktivasyondan korumak için uygulanan metotları ortaya çıkarmıştır. Bitkilerde bulunan PAL enziminin doğal enzim desteği olarak kullanımı, farklı enkapsülasyon teknikleriyle oluşturulan PAL enzimi, PEGlasyon yöntemiyle üretilen PAL alternatif yöntemleri oluşturmaktadır. Bu alternatif yöntemler sayesinde enzimin stabilitesi geliştirilmiş ve immun cevabı önlemek için nasıl cevap vereceği tespit edilmiştir. 







KAYNAKLAR


3. Abell, C. W., and Shen, R.-S. (1987). Phenylalanine ammonia-lyase from the yeast Rhodotorula glutinis. Methods Enzymol. 142: 242 – 249.
4.  Ambrus, C. M. (1982).  Depletion  of phenylalanine in the blood of phenylketonuric patients using a PAL-enzyme reactor: an in vitro study.  Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 37:  105 – 111. 
5. Ateş, S., Doğan, N. S., 2010. Properties of Immobilized Phenylalanine Ammonia Lyase and Investigation of its Use for the Prediagnosis of Phenylketonuria. Türk Biyokimya Dergisi. 35: 58–62.
6. Aydas, S. B., Özturk, S., Aslım, B., 2013. Phenylalanine ammonia lyase (PAL) enzyme activity and antioxidant properties of some cyanobacteria isolates. Food Chemistry. 136, 164–169. 
7. Bourget, L., and Chang, T. M. (1984). Artificial cell-microencapsulated phenylalanine ammonia-lyase.  Appl. Biochem. Biotechnol. 10:  57 – 59.
8. Bourget, L., and Chang, T. M. (1986). Phenylalanine ammonia-lyase immobilized in microcapsules   for   the  depletion   of   phenylalanine   in   plasma   in   phenylketonuric   rat model.  Biochim. Biophys. Acta 883:  432 – 438.
9. Bourget, L., and Chang, T. M. (1989). Effects of oral administration of artificial cells immobilized phenylalanine ammonia-lyase on intestinal amino acids of phenylketonuric rats.  Biomater. Artif. Cells Artif. Organs 17:  161 – 181.
10. Bourget, L., Chang, T. M. S., 1985. Phenylalanine ammonia-lyase immobilized in semipermeable microcapsules for enzyme replacement in Phenylketonuria. FEBS LETTERS. 180. 5-8. 
11. Chalutz, E., 1973. Ethylene-induced Phenylalanine Ammonia-Lyase Activity in Carrot Roots. Plant Physiol 51, 1033-1036. 
12. Chang, T. M., Bourget, L., and Lister, C. (1995). A new theory of enterorecirculation of amino acids and its use for depleting unwanted amino acids using oral enzyme-artificial cells, as in removing phenylalanine in phenylketonuria.  Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 23:  1 – 21.
13. Chmielowska, J., Deckert, J., Diaz, J., 2008. Activity of peroxidases and phenylalanine ammonia-lyase in lupine and soybean seedlings treated with copper and an ethylene inhibitor.  Biological Lett.,  45: 59.67.
14. Cui, J. D., Li, L. L., Bian, H. J., 2013. Immobilization of Cross-Linked Phenylalanine Ammonia Lyase Aggregates in Microporous Silica Gel.  PLOS ONE, 8:1-8. 
15. Cui, J. D., Sun, L. M., Li, L. L., 2013. A Simple Technique of Preparing Stable CLEAs of Phenylalanine Ammonia Lyase Using Co-aggregation with Starch and Bovine Serum Albumin. Appl Biochem Biotechnol. 170:1827–1837.  
16. Cui, J. D., Zhang, S., Sun, L. M., 2012. Cross-Linked Enzyme Aggregates of Phenylalanine Ammonia Lyase: Novel Biocatalysts for Synthesis of L-Phenylalanine. Appl Biochem Biotechnol.167:835–844. 
17. Cunha, G. B. D., Satyanarayan, V., Nair, P. M., 1996. Stabilization of phenylalanine ammonia lyase containing Rhodotorula glutinis cells for the continuous synthesis of L-phenylalanine methyl ester/96/. Enzyme and Microbial Technology 19:421-427. 
18. Fritz, R. R., Hodgins, D. S., Abell, C. W., 1976. Phenylalanine ammonia-lyase. Induction and purification from yeast and clearance in mammals. J. Biol. Chem., 251:4646-4650.
19. Gamez, A., Sarkissian, C. N., Wang, L., Kim, W., Straub, M., Patch, M. G., Chen, L., Striepeke, S., Fitzpatrick, P., Lemontt, J. F., O’Neill, C., Scriver, C. R., Stevens, R. C., 2005. Development of Pegylated Forms of Recombinant Rhodosporidium toruloides Phenylalanine Ammonia-Lyase for the Treatment of Classical Phenylketonuria. Molecular Therapy, 11, 986-989.
20. Gilbert, H. J., and Tully, M. (1985). Protection of phenylalanine ammonia-lyase from proteolytic attack. Biochem. Biophys. Res. Commun. 131: 557 – 563.
21. Goldson, A.,  Lam, M.,  Scaman, C. H., Clemens, S..,  Kermode, A., 2008. Screening of phenylalanine ammonia lyase in plant tissues, and retention of activity during dehydration. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88:619–625. 
22. Habibi-Moini, S., D’mello, A.P., 2001. Evaluation of possible reasons for the low phenylalanine ammonia lyase activity in cellulose nitrate membrane microcapsules. Int. J. Pharm. 215, 185–196.
23. Havir, E. A., Hanson, K. R., 1968. L-Phenylalanine Ammonia-lyase. I. Purification and Molecular Size of the Enzyme from Potato Tubers. Biochemistry. 7. 1896-1903. 
24. Heredia, J. B., Cisneros-Zevallos, L., 2009. The effect of exogenous ethylene and methyl jasmonate on pal activity, phenolic profiles and antioxidant capacity of carrots (Daucus carota) under different wounding intensities. Postharvest Biology and Technology. 51.242–249. 
25. Hodgins, D. S., 1971. Yeast Phenylalanine Ammonia-lyase: Purification , properties, and the identification of catalytically essential dehydroalanine. J. Biol. Chem., 246:2977-2985.
26. Hussain, P. R., Wani, A. M., Meena, R. S., Dar, M. A., 2010. Gamma irradiation induced enhancement of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and antioxidant activity in peach (Prunus persica Bausch, Cv. Elberta). Radiation Physics and Chemistry. 79. 982–989. 
27. Inoue, S., Matsunaga, Y., Iwane, H., Sotomura, M., and Nose, T. (1986). Entrapment of phenylalanine ammonia-lyase in silk fibroin for protection from proteolytic attack.  Biochem. Biophys. Res. Commun. 141:  165 – 170. 
28.   Kalghatgi,   K.,  Horvath,   C.,  and   Ambrus,   C.   M.   (1980).   Multitubular   reactors   with immobilized L-phenylalanine ammonia-lyase for use in extracorporeal shunts.  Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 27:  551 – 561.
29. Kane, J. F., Fiske, M. J., 1985. Regulation of Phenylalanine Ammonia Lyase in Rhodotorula glutinis. Journal of Bacteriology. 161. 963-966.
30. Kim, S. H., Kronstad,  J.W., Ellis, B.E., 1996. Purification and characterization of phenylalanine ammonia-lyase from Ustilago maydis. Phytochemistry. 43, 351-357.
31. Kim, W, Erlandsen, H, Surendran, S, Stevens, R. C, Gamez, A., Michols-Matalon, K., Tyring, S. K., Matalon R., 2004. Trends in enzyme therapy for phenylketonuria. Mol Ther. 10:220-4.
32.  Lam, M., Scaman, C. H.., Clemens, S., Kermode, A., 2008. Retention of Phenylalanine Ammonia-lyase Activity in Wheat Seedlings during Storage and in Vitro Digestion. J. Agric. Food Chem., 56, 11407–11412.
33. Larue, C., Munnich, A., Charpentier, C., Saudubray, J.M., Frézal, J., Rémy, M.H., Rivat, C. 1986. An extracorporeal hollow-fiber reactor for phenylketonuria using immobilized phenylalanineammonia lyase. Developmental Pharmacology and Therapeutics. 9, 73-81.  
34. Levy, H., 1999. Phenylketonuria: Old disease, new approach to treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 96: 1811–1813.
35. Lopez-Galvez, G., Saltveit, M., Cantwell, M., 1996. Wound-induced phenylalanine ammonia lyase activity: factors affecting its induction and correlation with the quality of minimally processed lettuce. Postharvest biology and technology. 9. 223-233. 
36. Maldonado, R., Goni, O., Escribano, M. I., Merodio, C., 2007. Regulation of phenylalanine ammonia-lyase enzyme in Annona Fruit: Kinetic characteristics and inhibitory effect of ammonia. Journal of Food Biochemistry. 31. 161–178.
37. Marconi W, Bartoli F, Gianna R, Morisi F, Spotorno G., 1980. Phenylalanine ammonia-lyase entrapped in fibers. Biochimie. 62:575-80. 
38. Martinez, M. A., Lafuente, M. T., 1997. Effect of High Temperature Conditioning on Ethylene, Phenylalanine Ammonia-lyase, Peroxidase and Polyphenol Oxidase Activities in Flavedo of Chilled <Fortune> Mandarin Fruit. J Plant Physiol 150. 674-678.
39. Pereyra, L., Roura, S. I., del Valle, C. E., 2005. Phenylalanine ammonia lyase activity in minimally processed Romaine lettuce. Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 38. 67–72. 
40. Reichert, A. I., He, X. Z., Dixon, R. A., 2009. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) from tobacco (Nicotiana tabacum): characterization of the four tobacco PAL genes and active heterotetrameric enzymes. Biochem. J. ,424, 233–242. 
41. Ronald, P., Soderhall, K., 1985. Phenylalanine ammonia lyase and peroxidase activity in mycorrhizal and nonmycorrhizal short roots of scots pine, Pinus sylvestris L. New Phytol., 101, 487-494.
42. Sarkissian, C. N., et al. (1999). A different approach to treatment of phenylketonuria: phenylalanine degradation with recombinant phenylalanine ammonia lyase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2339 – 2344.
43. Sarkissian, C. N., Gámez, A., 2005. Phenylalanine ammonia lyase, enzyme substitution therapy for phenylketonuria, where are we now?.  Molecular Genetics and Metabolism. 86. 22–26.
44. Shah, R. M., D’mello, A. P., 2008. Strategies to maximize the encapsulation efficiency of phenylalanine ammonia lyase in microcapsules. International Journal of Pharmaceutics. 356. 61–68. 
45. Whetten, R. W., Sederoff, R. R., 1992. Phenylalanine Ammonia-Lyase from Loblolly Pine: Purification of the Enzyme and Isolation of Complementary DNA Clones. Plant Physiol. 98, 380-386.
46. Zhang, Y., Jia, X.,  Wang, L., Liu, J., Ma, G., 2011. Preparation of Ca-Alginate Microparticles and Its Application for Phenylketonuria Oral Therapy. Ind. Eng. Chem. Res., 50, 4106–4112.


Yazarın diğer yazıları